甲氧芐氨嘧啶檢測試劑盒使用說明書（酶聯(lián)免疫法）

1 原理及用途
本試劑盒采用競爭ELISA方法檢測組織、飼料、尿樣和血清等樣品中的甲氧芐氨嘧啶（Trimethoprim，TMP），試劑盒由預包被甲氧芐氨嘧啶抗體的酶標板、TMP酶標記物、標準品及其他配套試劑組成。檢測時，加入標準品或樣品溶液，樣本中的甲氧芐氨嘧啶和TMP酶標記物競爭酶標板上預包被的甲氧芐氨嘧啶抗體，用TMB底物顯色后，樣本吸光度值與樣本甲氧芐氨嘧啶含量成負相關(guān)，與標準曲線比較即可得出樣本中甲氧芐氨嘧啶的殘留量。
2 甲氧芐氨嘧啶檢測試劑盒技術(shù)指標
2.1 試劑盒靈敏度：0.015ppb(ng/ml)
2.2 反應模式：37℃，45min～15min
2.3 檢測下限：
飼料……………………………………0.8ppb
組織（魚/蝦/肉/肝臟/腎臟）………0.2ppb
血清/尿液/血漿………………………0.2ppb
2.4 交叉反應率：
甲氧芐氨嘧啶…………………………100%
磺胺吡啶……………………………<0.1%
磺胺…………………………………<0.1%
磺胺嘧啶……………………………<0.1%
磺胺異噁唑…………………………<0.1%
磺胺噻唑……………………………<0.1%
磺胺甲基嘧啶………………………<0.1%
磺胺多辛……………………………<0.1%
 2.5 樣本回收率：
飼料……………………85%±10%
組織（魚/蝦/肉/肝臟/腎臟）………85±15%
血清/尿液/血漿………………………85±10%
3 試劑盒組成
酶標板……………………………96孔
標準液（黑蓋）：各1ml
0ppb、0.015ppb、0.045ppb、0.135ppb、0.405ppb、1.215ppb
高標準液：100ppb…………………1ml
酶標記物（紅蓋）…………………5.5ml
底物液A（白蓋）……………………6ml
底物液B（黑蓋）……………………6ml
終止液（黃蓋）………………………6ml
2×復溶液………………………50ml
20X濃縮洗滌液（白蓋）……………40ml
說明書…………………………………1份
4 需要的器材和試劑
4.1 儀器：酶標儀、打印機、均質(zhì)器 、氮氣吹干裝置、振蕩器、離心機、刻度移液管、天平（感量0.01g）
4.2 微量移液器：單道20µl-200µl，100µl-1000µl、多道300µl
4.3 試劑：無水甲醇、正己烷、鹽酸、氫氧化鈉
5 樣本前處理
5.1 樣本處理前須知：
實驗器具必須潔凈并使用一次性吸頭，以避免污染干擾實驗結(jié)果。
5.2 配液：
配液1：1×復溶液
    將2×復溶液用去離子水2倍稀釋。
配液2：0.1M鹽酸
    取濃鹽酸10ml加入到1200ml離子水中。
配液3：1M氫氧化鈉
    取氫氧化鈉4g加入到100ml離子水中。
5.3 樣本前處理步驟：
5.3.1 飼料處理方法 
1）稱取2g粉碎樣品于50ml離心管中，加20ml 0.1M鹽酸，振蕩15分鐘，室溫3000轉(zhuǎn)/分離心10分鐘；
2）取1ml上清到1.5ml離心管，加入55ul 1M氫氧化鈉調(diào)節(jié)PH值到6-8，混勻（針對不同的飼料樣品可以調(diào)節(jié)1M氫氧化鈉的用量），室溫3000轉(zhuǎn)/分離心10分鐘；
3）取0.5ml上清到另一1.5ml離心管，加入0.5ml的1×復溶液，混勻；
3）取50μl進行分析。
    樣本稀釋倍數(shù)：20    檢測下限：0.8ppb
5.3.2 組織（魚/蝦/肉/肝臟/腎臟）處理方法 
1）取除去脂肪的勻漿組織2g于50ml離心管中，加入6 ml無水甲醇和2ml正己烷，zui大速度渦旋振蕩5分鐘；
2）室溫4000轉(zhuǎn)/分離心10分鐘，去除上層正己烷層，移取0.5ml下層清液到潔凈玻璃試管試管（避免觸碰脂肪層）；
3）在50-60℃下氮氣吹干或蒸干樣品；
4）加入400ul的1×復溶液和500ul正己烷，zui大速度渦旋振蕩1分鐘；
5）轉(zhuǎn)入1.5ml離心管，室溫4000轉(zhuǎn)/分離心5分鐘，去除上層正己烷層，移取50ul下層清液進行分析。
    樣本稀釋倍數(shù)：5    檢測下限：0.2ppb
5.3.3 尿液/血清/血漿處理方法
1）取0.5 ml 樣品，室溫4000轉(zhuǎn)/分離心5分鐘；
2）取50µl上清液，加入200µl 1×復溶液，混勻；
3）取50µl用于檢測。
    樣本稀釋倍數(shù)：5    檢測下限：0.2ppb
（如果需要，可以加大1×復溶液的用量來加大稀釋倍數(shù)）
6 酶聯(lián)免疫試驗步驟
    將所需試劑從4℃冷藏環(huán)境中取出，置于室溫平衡30min以上, 洗滌液冷藏時可能會有結(jié)晶需恢復到室溫以充分溶解，每種液體試劑使用前均須搖勻。取出需要數(shù)量的微孔板及框架，將不用的微孔板放入自封袋，保存于2-8℃。
實驗開始前，用去離子水將20×濃縮洗滌液按20倍稀釋成工作洗滌液。
6.1 編    號：將樣本和標準品對應微孔按序編號，每個樣本和標準品做2孔平行，并記錄標準孔和樣本孔所在的位置。
6.2 加樣反應：加標準品或樣本50µl/孔到各自的微孔中，然后加酶標記物50µl/孔，用蓋板膜封板，輕輕振蕩5秒混勻，37℃反應45分鐘。
6.3 洗    滌：小心揭開蓋板膜，將孔內(nèi)液體甩干，用工作洗滌液250µl/孔充分洗滌5次，每次間隔30秒，用吸水紙拍干（拍干后未被清除的氣泡可用干凈的槍頭刺破）。
6.4 顯    色：每孔加入底物液A 50µl，再加底物液B 50µl，輕輕振蕩5秒混勻，37℃避光顯色15分鐘。
6.5 終    止：每孔加入終止液50µl，輕輕振蕩混勻，終止反應。
6.6 測吸光值：用酶標儀于450nm處測定每孔吸光度值（建議用雙波長450/630nm）。測定應在終止反應后10分鐘內(nèi)完成。
7 結(jié)果分析
7.1 百分吸光率的計算
    標準液或樣本的百分吸光率等于標準液或樣本的百分吸光度值的平均值（雙孔）除以*個標準液（0ppb）的吸光度值，再乘以100%，即
 百分吸光度值（%）＝
A
×100%
A0
A—標準溶液或樣本溶液的平均吸光度值
A0—0ppb標準溶液的平均吸光度值
7.2 標準曲線的繪制與計算
    以標準液百分吸光率為縱坐標，對應的標準液濃度（ppb）的對數(shù)為橫坐標，繪制標準液的半對數(shù)曲線圖。將樣本的百分吸光率代入標準曲線中，從標準曲線上讀出樣本所對應的濃度，乘以其對應的稀釋倍數(shù)即為樣本中待測物的實際濃度。
    若利用試劑盒專業(yè)分析軟件進行計算，更便于大量樣本的準確、快速分析。（索?。?br />8 注意事項
8.1 室溫低于25℃或試劑及樣本沒有回到室溫（25℃）會導致所有標準的OD值偏低。
8.2 在洗板過程中如果出現(xiàn)板孔干燥的情況，則會出現(xiàn)標準曲線不成線性，重復性不好的現(xiàn)象。所以洗板拍干后應立即進行下一步操作。
8.3 混合要均勻，洗板要*，在ELISA分析中的再現(xiàn)性，很大程度上取決于洗板的*性。
8.4 在所有孵育過程中，用蓋板膜封住微孔板，避免光線照射。
8.5 不要使用過了有效期的試劑盒，不要交換使用不同批號試劑盒中的試劑。
8.6 顯色液若有任何顏色表明變質(zhì)，應當棄之。0標準的吸光度值小于0.5個單位（A450nm< 0.5 ）時，表示試劑可能變質(zhì)。
8.7 反應終止液有腐蝕性，避免接觸皮膚。
9 貯藏及保存期
儲藏條件：試劑盒于2-8℃保存，避免冷凍。
保 質(zhì) 期：該產(chǎn)品有效期為1年，生產(chǎn)日期見包裝盒。